HOOKE微课堂丨拉曼光谱仪基础知识

首先介绍一下什么是共聚焦拉曼显微技术：

图片来源：王凤平.生物与纳米结构的共聚焦显微拉曼技术

典型的拉曼光谱仪工作原理

共聚焦的含义就是样品点聚焦在物镜的焦平面上，而收集到的拉曼散射光聚焦到共聚焦针孔里，形成物镜焦点和共聚焦针孔的两点共轭。

共聚焦拉曼技术作为应用最广泛的拉曼技术，其具有很好的空间分辨率，可以通过位移台的升降来控制光斑聚焦在样品上的位置和深度，将激光对样品的光损伤降到最低。而且一般来说，激光不仅可以激发样品点的拉曼信号，还会激发样品点前后环境的拉曼信号，共聚焦系统可以有效的将除样品点以外的信号过滤掉，获得纯净的样品信号。

共聚焦拉曼系统主要包括光源、外光路系统、光谱仪三个部分。

外光路系统主要是指激光到达样品和拉曼散射光到达光谱仪之间前的一套光学系统。这个系统主要包括滤光片、反射镜、显微镜等光学元件，可以保证激发光的单色性、去除拉曼光之外的杂散光、高效率地把拉曼光引入光谱仪中。拉曼光强度非常弱，所以如何高效率地将拉曼光引入光谱仪就是一个十分重要的问题，一般光谱仪的入口都是狭缝，稳定性十分差，一旦受到外部影响，如振动，就会影响系统光谱质量，而使用光纤不仅可以大大提高系统稳定性，而且光纤移动方便，大大方便了系统光路优化过程。

光谱仪作为系统的重要组成部分，其参数会对光谱质量起到至关重要的影响。

图片来源：CTIMES. 晶片上拉曼光谱仪问世 开创多元的材料分析应用

图中就表示了光谱仪的一种光路构造，光谱仪一般由入射狭缝、准直镜、光栅、聚焦镜、CCD探测器构成：

狭缝：

狭缝的作用是控制入射光线的宽度，其大小直接影响到光谱仪的分辨率，一般来说狭缝越小，光谱分辨率越高，但是狭缝过小，信号光就会变得很弱，所以适度的狭缝宽度对光谱仪是一个重要的影响因素。

光栅：

光栅是利用衍射原理将平行光发生色散，分解成光谱的光学器件，光栅按类型分为透射式光栅和反射式光栅，透射式光栅是在透明玻璃上刻蚀平行线，线之间的狭缝可以透光，可以达到衍射分光的效果，但是透射式光栅性能较差，应用也不多。反射式光栅是在镀膜的高反射银镜上刻蚀平行线，一般来说常用的有600g/mm、1200g/mm、1800g/mm三种，线对越多光谱分辨率越高，而光谱覆盖范围就会越窄。

光谱仪的选择

一般来说如何选择光谱仪，主要关心的就是光谱范围和光谱分辨率，对于材料如：硅片、PMMA、PS，药品：盐酸头孢、万古霉素、对乙酰氨基酚，微塑料，其峰位较为明显，一般来说其对光谱范围要求较高，对光谱分辨率要求较低，600g/mm光栅和普通CCD就可满足需求。

而对细菌、藻类之类的微生物来说，其峰位密度较大，强度弱，此时就需要选择刻线数更高的光栅以及性能更优异的CCD探测器来高光谱分辨率。